人脐带间充质干细胞外泌体对高糖诱导脐静脉内皮细胞功能的影响

摘要：目的 探讨人脐带间充质干细胞(hUMSCs)外泌体对高糖诱导人脐静脉内皮细胞(hUVECs)功能的影响.方法 酶消化法原代培养hUMSCs和hUVECs,传代扩增至第3代,采用流式细胞仪分别鉴定2种细胞表面标志物;收集培养的第3代hUMSCs无血清培养基,提取外泌体,在电镜下观察其超微结构,并用流式细胞分析仪鉴定其表面标志物;体外培养第3代hUVECs分为对照组、高糖组(20 mmol/L)、外泌体+高糖组(20 mmol/L)、miR-22抑制剂(50 nmol/L)+高糖组(20 mmol/L),孵育24 h后采用Annexin V/PI双染流式细胞术观察hUVECs凋亡,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察各组细胞的增殖能力,Transwell系统中观察各组细胞的迁移功能,成血管实验检测各组内皮细胞功能.结果 流式细胞术检测第3代hUMSCs的表面标志物CD105、CD73、CD90呈高表达;同时检测第3代hUVECs表面标志物CD309、CD31、CD34呈高表达,提示分离培养的hUMSCs和hUVECs具有间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和内皮细胞(endothelial cells,ECSs)特异性表型特征.外泌体扫描电镜观察可见大小不一的球状膜性结构,且流式细胞仪检测CD63、CD105、CD73、CD90、CD44呈阳性表达.MTT法检测各组细胞增殖结果:对照组、高糖组、miR-22抑制剂+高糖组、外泌体+高糖组细胞存活率分别为(99.0±1.6)%、(75.0±2.2)%、(66.0±1.8)%、(95.0±2.6)%,与对照组比较,高糖组和miR-22抑制剂+高糖组细胞增殖明显下降,差异均有统计学意义(t=28.271,P<0.05;t=43.213,P<0.01),外泌体+高糖组细胞增殖无明显下降,差异无统计学意义(t=2.001,P>0.05).流式细胞仪检测各组细胞凋亡结果:对照组、高糖组、miR-22抑制剂+高糖组、外泌体+高糖组细胞凋亡率分别为16.44%、52.67%、45.92%、17.58%,与对照组比较,高糖组和miR-22抑制剂+高糖组细胞凋亡率明显增高,差异均有统计学意义(t=-13.756、-16.489,均P<0.01),外泌体+高糖组细胞凋亡率略有增高,差异无统计学意义(t=-2.182,P>0.05).Transwell系统中观察细胞的迁移功能:对照组、高糖组、miR-22抑制剂+高糖组、外泌体+高糖组细胞迁移数量分别为834.5个、295.8个、252.2个、779.5个,与对照组比较,高糖组和miR-22抑制剂+高糖组细胞迁移数量明显减少,差异均有统计学意义(t=18.280、27.266,均P<0.01),外泌体+高糖组细胞迁移数量略有减少,差异无统计学意义(t=1.985,P>0.05).体外成管实验结果:对照组、高糖组、miR-22抑制剂+高糖组、外泌体+高糖组细胞成管数量分别为29.8个、13.3个、11.3个、29.6个,与对照组比较,高糖组和miR-22抑制剂+高糖组细胞成管数量明显减少,差异均有统计学意义(t=9.030,P<0.05;t=10.671,P<0.01),外泌体+高糖组细胞成管数量略有减少,差异无统计学意义(t=0.083,P>0.05).结论 hUMSCs外泌体可有效抑制高糖诱导hUVECs的凋亡、促进细胞增殖、迁移和血管再生作用,为寻找糖尿病微血管病变治疗的新靶点提供实验依据.